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CD19 CAR-T 在复发/难治B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）中已取得高缓解率，但快速制备且体内持久性良好仍是重大挑战。传统CAR-T制备需10–14天体外培养，易导致T细胞分化、耗竭和干性丢失，且延迟治疗。CD45RA阴性T细胞（即CD45RO+记忆T细胞）具有持久的抗白血病活性和记忆保留能力。
学者开发了一种快速（3天）制备方案——InstanCAR-T，富集CD45RA阴性T细胞，并在体外、小鼠模型及I期临床试验中系统比较了其与传统CAR-T（ConvenCAR-T）的差异。
研究方法
CAR-T制备：
ConvenCAR-T：CD3/CD28 Dynabeads激活，培养10天。
InstanCAR-T：CD4+/CD8+磁珠富集，TransAct激活，培养3天，优先富集CD45RA阴性记忆T细胞亚群。
两者均使用CD19 CAR慢病毒转导。
体外功能实验：慢性肿瘤刺激实验（Nalm6-LAE细胞，E:T=1:1，隔天重复刺激）。
小鼠模型：NCG小鼠接种Nalm6-LAE建立B-ALL异种移植模型，随机接受InstanCAR-T、ConvenCAR-T或对照T细胞。
临床试验：
InstanCAR-T：单中心、开放标签I期试验（NCT06209671），患者≥3岁。
ConvenCAR-T：作为对照的历史队列（NCT05309213），患者3–25岁。
预处理：氟达拉滨+环磷酰胺。
InstanCAR-T剂量：1×10⁷（DL-1）和2×10⁷（DL-2）总T细胞。
高维免疫分析：单细胞RNA测序（scRNA-seq）、质谱流式（CyTOF）。
研究结果
CD45RA阴性表型富集与体内扩增相关
产品中Tscm/naive（CD45RA+CD62L+） 与第14天扩增呈负相关；
Tcm（CD45RA-CD62L+）和Tem（CD45RA-CD62L-） 与扩增呈强正相关；
CD45RA-细胞总比例与第14天CAR-T计数呈正相关，CD45RA-富集产品患者扩增显著更强。
CD45RA-CD45RO+亚群在慢性刺激下表现更优
传统扩增过程中CD45RA-比例逐渐下降；
分选后比较：
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CD45RA-CD45RO+ 亚群激活更强（CD69、CD25、4-1BB MFI更高）；
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早期杀伤相当，但第8天CD45RA-CD45RO+仍保持>95%杀伤，而CD45RA+CD45RO-显著下降；
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CD45RA-CD45RO+增殖能力显著更强；
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两亚群分化和CD4/CD8动态不同。
InstanCAR-T在体外保留CD45RA-亚群，扩增和持久性增强
InstanCAR-T产品中CD45RA-比例显著高于ConvenCAR-T；
慢性刺激下：
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第3天杀伤相当，但第12天ConvenCAR-T失去杀伤活性，InstanCAR-T仍保持强杀伤；
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InstanCAR-T维持稳定CAR表达和显著更强扩增；
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InstanCAR-T凋亡更少，BCL-2/BAX比值更高；
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代谢分析：InstanCAR-T糖酵解和线粒体氧化代谢均增强（ECAR、OCR、基础/最大/ATP相关呼吸均显著更高）。
InstanCAR-T在小鼠模型中扩增和持久性增强
低剂量InstanCAR-T（0.5×10⁶）vs 高剂量ConvenCAR-T（2×10⁶）：
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肿瘤消除起效稍晚（第7天 vs 第3天），但初期肿瘤控制相当；
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InstanCAR-T初始植入较低，但扩增更快，第9天超过ConvenCAR-T并持续更高；
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CAR-T扩增AUC显著更大，表明体内扩增和持久性更优。
临床安全性和疗效相当
共纳入InstanCAR-T组10例，ConvenCAR-T组9例。
中位随访：InstanCAR-T 16.1个月，ConvenCAR-T 16.6个月。
InstanCAR-T组年龄更大（中位36 vs 18岁，P<0.001）。
CRS和ICANS发生率和严重程度两组相当，无显著差异，无明确剂量依赖性；大多为1–2级，每组仅1例3级CRS。
第28天疗效：
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ORR：90.0% vs 88.8%；
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CR：30.0% vs 33.3%；CRi：50.0% vs 0%；MLFS：10.0% vs 55.6%；
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MRD阴性率：90.0% vs 77.8%（P=0.582）；
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每组各有4例后续接受HSCT；
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复发：InstanCAR-T组4例（40.0%），ConvenCAR-T组4例（44.4%）。
InstanCAR-T在人体内扩增和持久性增强
峰值扩增时间：InstanCAR-T稍长（中位14天 vs 10天）；
InstanCAR-T扩增和持久性显著更强：
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AUC₀₋₂₈d：4678.50×10⁶·d/L vs 294.40×10⁶·d/L（P=0.0021）；
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Cmax：633.40×10⁶/L vs 51.84×10⁶/L（P=0.0535）。
血清细胞因子谱：IL-6在InstanCAR-T组倾向更高但无统计学差异，其他细胞因子相当。
单细胞转录组揭示InstanCAR-T的转录异质性和发育轨迹
第14天CAR-T细胞主要获得CD45RO+记忆表型，CD45RO+细胞CAR表达更高；
第14天CAR-T细胞激活和细胞毒性增强（GZMB、PRF1、GNLY、IFNG、CD38、CD69上调）；
伪时间分析显示CD8+中央记忆T细胞（Tcm） 在整个发育轨迹中持续存在，可能是长期持久性的关键储备；
CR患者富集CD8+ Tcm和增殖T细胞（Tprof），NR患者富集未分化亚群（Tn）；
CR晚期CD81选择性上调，NR晚期应激/抑制基因（STING1、PTGER2、UPP1）持续异常升高。
质谱流式验证表型稳定性和功能分化
第14天至第60天，Tnave和Tcm CAR-T亚群增加，耗竭标志物（PD-1、TIGIT、TIM3）降低（PB和BM）；
细胞毒性（IFN-γ、Granzyme B、Perforin）和趋化因子（CXCR3、CXCR5）在60天内保持稳定；
CD127+ CAR-T细胞（自我更新和分化潜能更强）从第14天到第60天增加；
CR组在所有时间点CD45RA- CAR-T比例均高于NR组（虽未达统计学显著，但趋势一致）。
InstanCAR-T治疗后内源性免疫细胞恢复
内源性T细胞亚群、细胞毒性和耗竭标志物在基线、第14、28、60天保持稳定；
PD-1在内源性T细胞第14天短暂升高，第28、60天下降，表明可逆激活状态；
NK细胞从第14天到第60天在PB和BM均显著增加。
总结
InstanCAR-T是一种3天快速制备方案，富集CD45RA阴性T细胞，保留记忆亚群、减少耗竭、维持强增殖能力。
与其他快速CAR-T平台相比，InstanCAR-T（4-1BB基础）表现出高频记忆样T细胞亚群和良好免疫动力学。
CD45RA-富集可能贡献于这些有利特性，但无法与其他制备相关因素完全分离。
尽管患者疾病负担更重，InstanCAR-T安全性良好：所有患者第28天可评估，仅10% 3级CRS，无≥3级ICANS。
scRNA-seq显示InstanCAR-T在第14天保留干性（TCF7、LEF1）和中央记忆转录程序；CyTOF确认激活和细胞毒性标志物持续表达，CD127+ CAR-T增加。
参考文献
X. Pei, M. Lv, X. Zhao, Z. Liu, L. Deng, Z. Zhou, Y. Ding, J. Liu, L. Zhang, Q. Jiang, X. Zhang, X. Lu, T. He, X. Huang, X. Zhao, Rapid Manufactured CAR-T Cells enriched for CD45RA-negative T cells Exhibit Superior Persistence Compared to Conventional CAR-T Therapy, Cancer Letters, https://doi.org/10.1016/j.canlet.2026.218865.